Abhigyan Choudhury ‡,
Nabarun C Das ‡,
Ritwik Patra ‡,
Manojit Bhattacharya,
Pratik Ghosh,
Bidhan C Patra E
Suprabhat Mukherjee 
Publicado online: 25 de março de 2021
https://doi.org/10.2217/fvl-2020-0342Tradução
Ricardo CamilloResumo
Objetivo: COVID-19 é atualmente a maior ameaça para a humanidade. Recentemente, a ivermectina (um medicamento antiparasitário aprovado pelo FDA dos EUA) foi explorada como um agente anti-SARS-CoV-2. Aqui, estudamos o possível mecanismo de ação da ivermectina usando abordagens in silico . Materiais e métodos: A interação da ivermectina contra as proteínas-chave envolvidas na patogênese do SARS-CoV-2 foi investigada por meio de docking molecular e simulação de dinâmica molecular. Resultados:A ivermectina foi encontrada como um bloqueador da replicase viral, protease e TMPRSS2 humano, o que poderia ser a base biofísica por trás de sua eficiência antiviral. A ação antiviral e o perfil ADMET da ivermectina estavam em pé de igualdade com os medicamentos anticorrosona usados atualmente, como a hidroxicloroquina e o remdesivir. Conclusão: Nosso estudo esclarece a candidatura da ivermectina como uma droga eficaz no tratamento da COVID-19.
Palavras-chave:
ivermectinadocking molecularproteasereplicaseSARS-CoV-2pico de glicoproteínaA família de vírus Coronaviridae gravou seu nome na história amaldiçoando a humanidade com três golpes principais - a síndrome respiratória aguda grave (SARS) causada por SARS-CoV, a síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS) causada por MERS-CoV e a última pandemia surto na forma de COVID-19 causado por SARS-CoV-2 [
1 ]. Até o momento, existem mais de 21,29 milhões de casos confirmados de COVID-19 em todo o mundo, que já custou 0,76 milhões de vidas até meados de agosto de 2020 [
2] O SARS-CoV-2 pertence ao gênero β-Coronavirus de um grupo 2B da família Coronaviridae. Esta cepa viral consiste em quatro proteínas estruturais principais, como a proteína S, que engloba o pico, E formando o envelope, M para a membrana e N para o nucleocapsídeo. Este nucleocapsídeo contém um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo de 29.903 bases [
3 ]. O vírus é transmitido de pessoa para pessoa principalmente por meio de contato físico próximo e por aerossóis respiratórios que são produzidos durante a tosse, espirro e até mesmo durante a fala [
4 ]. É bem assumido que o vírus também pode se espalhar por meio de matéria fecal e por transmissão de fômites, que ocorre quando uma pessoa entra em contato com uma superfície contaminada [
5] Viagens aéreas domésticas e internacionais irrestritas a partir de hotspots COVID também são consideradas contribuintes significativos para a propagação global desta infecção viral [
6 ].
Até o momento, várias postulações estão disponíveis a respeito do mecanismo da patogênese do vírus em um hospedeiro humano. No entanto, o caminho mecanicista real ainda é indefinido. Em geral, as gotículas de aerossol contendo a partícula do vírus ganham acesso ao sistema respiratório humano, justamente às membranas alveolares [
7 ]. Após sua entrada no sistema respiratório, o ectodomínio da glicoproteína de pico presente no capsídeo viral se liga à proteína do receptor transmembrana da enzima de conversão 2 (ACE2), conseqüentemente, o genoma do RNA entra nas células alveolares por endocitose mediada por receptor [
8] A RNA polimerase dependente de RNA viral (RDRP; replicase) é eventualmente traduzida de sua fita de mRNA com a ajuda de sua enzima protease principal, e a enzima replicase catalisa a replicação rápida do genoma viral ao lado de outras proteínas estruturais necessárias para reconstruir novas partículas virais [
8 ]. Além disso, as interações entre os antígenos virais e as células imunes do hospedeiro são consideradas um fator determinante crucial dos atributos imunopatológicos do COVID-19 [
9 ]. Respostas pró-inflamatórias induzidas por interações hospedeiro-vírus desencadeiam vasodilatação, acúmulo de fatores humorais que, em última análise, resultam em febre, troca alveolar anormal dificuldade respiratória, levando à morte de pacientes [
10 ].
Enquanto a pandemia se espalha mais rápido que os incêndios florestais, a indisponibilidade de medicamentos ratificados e / ou vacinas contra os mesmos tornou a situação mais alarmante. Nesse contexto, estudos recentes sobre o uso de hidroxicloroquina (um medicamento antimalárico) em combinação com o antibiótico azitromicina [
11 ] e medicamentos antirretrovirais como remdesivir, EIDD-2801 ou favipiravir mostraram eficácia contra SARS-CoV-2 [
12 ]. Com base nisso, a ivermectina foi recentemente relatada como o agente mais ativo contra COVID-19 entre os medicamentos aprovados pelo FDA dos EUA em ensaio in vitro [
13 ]. A ivermectina é uma lactona macrocíclica usada nativamente para tratar um amplo espectro de infestações parasitárias, incluindo filariose linfática e oncocercose [
14] Curiosamente, um estudo recente afirma que a droga inibe a replicação do SARS-CoV-2 em condição in vitro e pode reduzir a propagação do vírus em aproximadamente 5.000 vezes em 48 h, enquanto é testada in vitro usando linhagens de células de primatas [
13 ] . Considerando a promessa terapêutica da ivermectina contra COVID-19 [
15 ], o presente estudo foi conduzido para representar a eficácia desta droga contra as quatro proteínas funcionais mais cruciais da SARS-CoV-2 usando abordagens biocomputacionais avançadas. Além disso, a eficácia da ivermectina foi comparada com duas das drogas anticorrosivas recentemente usadas, a saber, a hidroxicloroquina e o remdesivir.
Materiais e métodos
Mineração de dados
A formulação comercial de ivermectina é composta por uma mistura racêmica de -O-dimetil-22,23-di-hidroavermectina B1a (ivermectina B1a) e 5-O-dimetil-22,23-di-hidroavermectina B1b (ivermectina B1b) e ambas as estruturas foram usadas neste estude. Estruturas 3D de homólogos de ivermectina, hidroxicloroquina e remdesivir foram recuperadas da biblioteca de compostos PubChem (
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ). As estruturas foram convertidas no formato .pdb para uso posterior. A estrutura de cada ligante de ivermectina obtida da biblioteca Pubchem foi convertida em conformador 3D (
Figura Suplementar 1A ) com energia mínima usando o servidor Frog2. Os conformadores 3D de remdesivir e hidroxicloroquina foram baixados da biblioteca PubChem. Todos esses conformadores 3D foram usados no estudo de docking proteína-ligante.
Sequências de aminoácidos de comprimento total da proteína do receptor ACE2 humano (ID de acesso: AAT45083.1), TMPRSS2 humano (ID de acesso: AAH51839.1), domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2 Spike S1 (RBD; ID de acesso: pdb | 6M17 | F) e a enzima replicase SARS-CoV-2 NSP9 (ID de acesso: pdb | 6W4B | A) foram recuperados do banco de dados de proteínas NCBI (
www.ncbi.nlm.nih.gov ). Além disso, a estrutura cristalina da protease SARS-CoV-2 (Protein Data Bank [PDB] ID: 6Y2E [DOI: 10.2210 / pdb6Y2E / pdb]) foi obtida do RCSB PDB (
www.rcsb.org ). A estrutura cristalina foi gerada ab initiousando técnicas de difração de raios-X com resolução de 1,75Å. Uma resolução abaixo de 3,0Å sugere um bom detalhamento estrutural que é desejável para estudos de docking molecular. Essa estrutura foi introduzida no aplicativo de software PyMOL, em que as moléculas de água presentes na estrutura cristalina original foram separadas e removidas da estrutura nativa da proteína para evitar interferências indesejáveis. Por outro lado, a estrutura da subunidade S2 da proteína spike foi modelada separadamente usando a sequência de aminoácidos de S2 e PDB ID 6VYB como um modelo. Estrutura cristalina do SARS-CoV-2 na forma nativa, o RDRP foi adquirido do PDB (ID: 6M71). A estrutura 3D das proteínas-alvo do SARS-CoV-2 e de humanos estão representadas na
Figura 1B-H suplementar .
Modelagem de homologia e validação de modelo
Estruturas 3D das proteínas / peptídeos alvo foram construídas por meio de estratégia de modelagem de homologia usando o software MODELLER (versão 9.24 x64 Windows). As qualidades estereoquímicas dos modelos gerados foram avaliadas pela determinação de Ramachandran Plots usando a ferramenta de avaliação estrutural fornecida pelo servidor da web SWISS-MODEL (
https://swissmodel.expasy.org/ ).
Docking molecular e visualização
As estruturas moleculares resolvidas obtidas a partir da modelagem de homologia de posfácio de PDB foram submetidas a docking proteína-ligante usando o pacote de software Hex 8.0.0. Hex 8.0.0 é um programa de acoplamento de proteína baseado em transformada de Fourier (FFT) em que as estruturas do receptor e do ligante foram alimentadas no programa em termos de arquivos PDB para interação com base na forma e nos parâmetros de correlação eletrostática. O resultado do estudo de docking para cada experimento também foi submetido à análise pós-processo usando potenciais otimizados para simulação de líquidos, minimização do campo de força para otimizar o E Tot globalresultado. Os valores de energia (valores E) foram registrados para cada complexo acoplado de saída. As estruturas dos complexos receptor-ligante acoplado foram posteriormente renderizadas e visualizadas usando o pacote de software Visual Molecular Dynamics (Ver. 1.9.3) e posteriormente interpretadas de acordo.
Interações alvo de drogas
As interações proteína-droga foram determinadas analisando os complexos acoplados usando o servidor Protein Ligand Interaction Profiler (PLIP) (
https://projects.biotec.tu-dresden.de/ ). PLIP é um software de código aberto baseado em Python que fornece uma análise e visualização completas das interações proteína-ligante não covalentes, mesmo no nível de um único átomo, que inclui sete tipos de interação principais, como ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos, empilhamento π, interações de cátions π , pontes de sal, pontes de água e ligações de halogênio.
Simulação dinâmica molecular
A dinâmica molecular de complexos fortemente acoplados entre as drogas e proteínas alvo (por exemplo, ivermectina e protease SARS-CoV-2 ou ivermectina e receptor humano ACE2 [hACE2]) foram realizadas através do servidor iMODS para explicar o movimento usual da proteína dentro das coordenadas internas através do normal análise de modo (NMA) [
16 ]. O iMODS é um servidor amigável e altamente personalizável que apresenta vários níveis de granulação grossa (CG). O servidor calcula as coordenadas diédricas de átomos Cα de macromoléculas grandes. Além disso, o iMODS calcula o fator B, a deformabilidade estrutural e calcula o valor próprio.
Determinação da energia livre de ligação
A molécula mais ativa de ivermectina B1b foi examinada quanto à sua eficácia de ligação contra o alvo mais favorável - o RDRP. A energia livre de ligação foi calculada usando o software AutoDock usando a seguinte fórmula:
Conversão fórmula = Kd=e{Δ G × 1000R T}ConversãoFórmula=Kd=e{ΔG×1000RT}
Análise in silico da farmacocinética
Os atributos farmacocinéticos comparativos, como absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) e citotoxicidade, bem como outras propriedades farmacológicas importantes (propriedades físico-químicas, lipofilicidade, solubilidade em água e semelhança com o medicamento) dos três medicamentos de escolha foram analisados utilizando SwissADME de acesso aberto servidor (
www.swissadme.ch/ ).
Resultados
Estudos de docking molecular
No presente estudo, docking molecular foi usado para explorar os alvos da ivermectina no SARS-CoV-2 e para determinar a eficácia terapêutica comparativa com hidroxicloroquina e remdesivir, que estão atualmente em uso para o tratamento de COVID-19. Ao trabalhar com os modelos moleculares, a qualidade de emulação da mecânica molecular é conhecida por depender da característica dos modelos usados para docking [
17 ]. Portanto, verificamos a qualidade estereoquímica de cada modelo. Verificou-se que todos os modelos apresentaram mais de 92% de resíduos em regiões favorecidas, podendo indicar uma qualidade estereoquímica ótima que pode ser utilizada para estudos posteriores (
Figura 2 Suplementar) Os estudos de docking conduzidos usando Hex fornecem o valor E para cada conformação de ligação, que é inversamente proporcional à eficiência de ligação da estrutura caracterizada pelo valor E negativo. Suspirando a confiança da avaliação acima, estudos de acoplamento de proteína-ligante foram realizados para obter informações sobre as conformações de ligação mais prováveis e eficientes da ivermectina com as proteínas de interesse. Os resultados foram fornecidos nas subseções subsequentes mencionadas a seguir.
Interação de ivermectina com a glicoproteína de pico de SARS-CoV-2
Nossos dados experimentais sobre o docking de ivermectina na proteína spike SARS-CoV-2 (na forma nativa) revelaram uma forte ligação do composto com um valor de energia de -261,74 e -287, respectivamente, para homólogos B1a e B1b. A proteína Spike é uma proteína homotrimérica com duas subunidades S1 funcionais e uma subunidade S2 estrutural [
18 ]. Portanto, verificamos o local de ligação real dos isômeros de ivermectina na proteína de pico por meio de docking separado usando as subunidades S1 e S2. Os resultados do docking molecular usando o programa de software Hex são mostrados na
Figura 1 A e na
Tabela 1. Observou-se que os homólogos da ivermectina podem se ligar tanto às subunidades S1 (o domínio de ligação ao receptor da proteína spike) quanto S2 da proteína spike SARS-CoV-2. Porém, a força da ligação dos isômeros da ivermectina foi mais intensa na subunidade S2 (
Figura 1 A e
Tabela 1 ). Valor de energia (E Tot- valores) para a interação de B1a e B1b foram -372,99 e -393,29 para a proteína S1 enquanto -395,9 e -411,6. Portanto, pode-se inferir que a ligação da ivermectina na subunidade S2 da proteína spike pode causar um efeito alostérico, que por sua vez pode induzir uma mudança conformacional na proteína inteira ou na subunidade S1 de ligação ao receptor. Verificou-se que a ivermectina B1a é a melhor molécula no direcionamento da proteína spike ou suas subunidades do que o isômero B1b. Também examinamos a estabilidade do complexo ivermectina-SARS-CoV-2 spike protein através da análise de docking molecular declarada na última parte do manuscrito.
Figura 1. Interações moleculares entre a subunidade S2 da proteína spike e a protease principal com ivermectina, respectivamente.
Posições de docking molecular exibindo conformação de ligação em modelos de preenchimento de espaço e interações não covalentes analisadas pelo servidor PLIP, entre (A) proteína da subunidade S2 e ivermectina e (B) protease principal e ivermectina.
PLIP: Perfilador de interação proteína-ligante.
Tabela 1. Interações proteína-ligante entre homólogos de ivermectina e proteína spike SARS-CoV-2.Domínio de ligação ao receptor S1
Ivermectina B1aIvermectina B1b
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaTYR51 3,87 6618 513 VAL185 3,01 6625 6174
ALA54 3,57 6593 542 TYR187 2,94 6624 4009
LYS60 3,27 6620 599
PRO66 3,61 6618 653
GLU88 3,58 6644 5224
ARG90 3,51 6643 5241
TYR187 3,71 6633 6190 Ligação de hidrogênio
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaSER55 2,62 6639 547 SER57 3,26 6618 4927
ASP87 4.09 6584 5217 ASN119 4,06 6621 5521
THR97 2,80 6616 5310
TYR187 3,18 6641 6192 Pontes de sal
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteína ARG85 3,37 6585, 6584 5156
ARG90 4,00 6605, 6607 5241 Subunidade S2
Ivermectina B1aIvermectina B1b
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaTHR182 3,00 16.986 7255 ARG224 3,25 16.964 13.252
GLU239 3,88 17.001 13.395 ALA225 3,59 16.957 13.267
LYS245 3,86 17.004 13.453 VAL231 3,96 16.960 13.312
ALA485 3,13 17.001 15.696 GLU232 3,90 16.963 13.319
ASP500 3,94 16.948 10.223 ASP409 2,99 16.980 9358
GLN413 3,42 16.967 9395Ligação de hidrogênio
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaTHR183 4,01 16.983 7258 ARG224 4,06 16.992 13.253
GLU239 3,80 17.000 13.399 GLU232 4,06 16.998 13.315
ASP500 3,83 16.945 10.226 ASN412 3,92 17.001 9386
LYS504 4,08 16.960 10.252 GLN413 3,47 16.996 9398
GLU476 3,81 16.997 10.002Protease principal SARS-CoV-2
Ivermectina B1aIvermectina B1b
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaTHR25 3,35 3258 221 THR169 3,70 2924 1605
MET165 3,80 3211 1565 ASN238 2,67 2946 2263
GLU166 3,56 3243 1579 TYR239 3,88 2933 2278
GLU166 3,43 3219 1578 LEU287 3,70 2944 2700
GLN189 3,78 3209 1787 Ligação de hidrogênio
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaASN142 3,12 3259 1357 THR169 3,79 2923 1606
GLY143 3,94 3202 1361 ALA194 3,77 2923 1827
GLU166 3,43 3217 1574 GLY195 2,61 2920 1833
TYR239 2,72 2945 2281
LEU287 3,67 2694 2889Replicase
Ivermectina B1aIvermectina B1b
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaPRO87 3,92 2173 732 ASP51 2,88 2180 384
LYS88 3,12 2144 741 LYS88 3,03 2176 740
LYS88 3,12 2150 741
VAL89 3,74 2178 753Ligação de hidrogênio ASP51 4,04 2189 380
VAL89 3,87 2157 748RNA polimerase dependente de RNA
Ivermectina B1AIvermectina B1B
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaASN496 3,69 10.471 4272 ASN496 3,81 10.450 4272
LYS500 3,99 10.461 4314 LYS500 3,04 10.431 4313
VAL557 3,76 10.457 4900 LYS545 3,30 10.460 4771
ALA685 3,91 10.464 6107 VAL557 2,96 10.459 4900Ligação de hidrogênio
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaASN496 2,60 10.470 4275 ASN497 3,68 10.452 4286
ASN497 3,33 10.468 4286 LEU544 3,58 10.471 4760
LYS500 2,83 10.472 4316 TYR546 3,60 10.471 4779
ILE548 3,54 10.450 10.450
ARG555 4,06 10.450 4878 Pontes de sal
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteína LYS500 5,37 10.415; 10.416 4314
LYS545 4,65 10.436; 10.438 4762
LYS545 3,97 10.441; 10.443 4762
ARG555 5,03 10.441; 10.443 4878 Proteína TMPRSS2 humana
Ivermectina B1aIvermectina B1b
Interação hidrofóbica
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaPRO369 3,78 3336 2167 VAL298 3,67 3337 1468
ASP482 3,16 3368 3210 VAL331 3,99 3334 1799
TRP483 3,79 3361 3219 VAL331 2,64 3337 1800
SER333 2,49 3340 1816Ligação de hidrogênio
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaASP220 4,05 3342 751 VAL331 3,62 3381 1798
ASP482 3,90 3365 3213
ASP482 3,61 3365 3206
TRP483 4,02 3353 3215 Pontes de sal
ResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaResíduoDistância (Å)Nº do átomo do ligandoNº do átomo de proteínaARG486 5,47 3353, 3355 3251
Interação da ivermectina com a protease principal SARS-CoV-2
Após verificar a interação com a proteína spike, examinamos a eficácia da ivermectina contra a principal protease viral. Os resultados do docking molecular após a interação proteína-ligante são apresentados na
Figura 1 B e na
Tabela 1 . Documentamos uma ligação intensa de ambos os isômeros ivermectina B1a e B1b à protease principal com valores de energia (E Tot -) subsequentes de -384,56 e -408,6. Para explorar os resíduos de interação do alvo, um complexo acoplado compreendendo protease e ivermectina foi analisado pela ferramenta PLIP. Foi observado que os resíduos Pro108, Phe134, Thr198, Pro241 e Thr243 da protease SARS-CoV-2 estavam envolvidos na formação de interações hidrofóbicas com ivermectina, enquanto o Gln107 estava envolvido na ligação de hidrogênio com o elemento ligante - o B1B homólogo (
Figura 1 B e
Tabela 1 ).
Interação de ivermectina com SARS-CoV-2 replicase e RDRP
A capacidade de transcrever RNA usando replicase e / ou RDRP é uma das marcas patogênicas únicas do SARS-CoV-2. Neste contexto, investigamos se a ivermectina poderia se ligar a maquinaria de síntese de RNA, em outras palavras, a replicase viral e / ou enzima RDRP ou não. Nossos dados revelaram que os homólogos 5-O-dimetil-22,23-diidroavermectina B1a e ivermectina B1b são capazes de se ligar à replicase viral (NSP9) com valor de energia respectivo de -327,47 e -352,2 (
Tabela 1 ). Além disso, também descobrimos que esta forte interação entre replicase e ivermectina é devido à intensa ligação de ivermectina no domínio RDRP (
Figura 2B). Verificou-se que o isômero da ivermectina B1b é a melhor molécula para formar uma interação forte com a replicase e que revelou uma interação muito fraca com a ivermectina, embora ambos os isômeros da ivermectina interajam com a proteína alvo (
Figura 2 A – B e
Tabela 1 ). Os principais resíduos de interação de ivermectina formando ligações não covalentes com replicase e RDRP são apresentados na
Figura 2 A – B. Da mesma forma que outros alvos proteicos, a afinidade de ligação da ivermectina B1b à replicase e / ou RDRP foi maior do que a ligação da ivermectina B1a (
Figura 2 A e B).
Figura 2. Interações de ligação de replicase viral, RNA polimerase dependente de RNA e TMPRSS2 humano com ivermectina.
Configurações de docking mostrando modos de ligação em modelos de preenchimento de espaço e interações não covalentes analisadas por servidor PLIP entre (A) proteína replicase viral e homólogo de ivermectina B1b, (B) RDRP e homólogo de ivermectina B1b e (C) ivermectina e TMPRSS2 humano.
PLIP: Perfilador de interação proteína-ligante; RDRP: RNA polimerase dependente de RNA.
Interação da ivermectina com a proteína receptora ACE2 humana
SARS-CoV-2 spike protein objetos para utilizar ACE2 humano para ligação e entrada viral. No entanto, ACE2 também é importante para manter a função fisiológica normal no corpo humano. Docking molecular de ivermectina com a proteína ACE2 exibiu ligação fraca de ivermectina B1a (valor E: -81,85) e B1b (valor E: -91,4) (
Tabela 1 ;
Tabela Suplementar 1 e
Figura Suplementar 3 ). Estudos sobre as interações proteína-ligante dos complexos de docking explorados ainda mais hACE2-ivermectina é regulada principalmente por interações hidrofóbicas em que resíduos Asp299, Val298 e Ala301 de hACE2 estiveram principalmente envolvidos (
Tabela Suplementar 1) A inferência obtida do docking molecular foi posteriormente verificada por dinâmica de simulação (declarada na seção subsequente).
Interação da ivermectina com a proteína receptora TMPRSS2 humana
O TMPRSS2 desempenha um papel crucial na entrada mediada por ACE2 nas células humanas e na patogênese do SARS-CoV-2. Portanto, TMPRSS2 poderia ser um alvo terapêutico e estudamos a interação entre ivermectina e proteína TMPRSS2. Como representado na
Tabela 1 , ivermectina B1a e B1b foram encontrados para se ligar a TMPRSS2 com respectivo valor de energia de -392,75 e -382,9. A ligação da ivermectina é orquestrada principalmente pela formação de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas (
Figura 2 C e
Tabela 1 ). Curiosamente, a ligação da ivermectina a hTMPRSS2 também revelou que a ivermectina tem preferencialmente como alvo a zona de ligação quando a proteína S1 ocupa [
19] Essa interação forte indicou o potencial da ivermectina para interromper a interação vírus-hospedeiro. A estabilidade da interação foi verificada por simulação dinâmica molecular.
Simulação dinâmica molecular
O estudo da dinâmica molecular desempenhou um papel crítico para validar a ligação proteína-ligante, o que pode ser demonstrado comparando a dinâmica da proteína de seu modo normal. No estudo atual, a dinâmica molecular essencial também foi empregada para o número selecionado de modos normais de proteína para determinar sua estabilidade e mobilidade através do servidor iMODS. Nós estudamos a dinâmica de ligação de dois complexos acoplados significativos compreendendo ivermectina B1b-replicase viral e ivermectina B1b-RDRP (
Figura 3 ). O resultado dos iMODs direcionou a mobilidade dos domínios um em direção ao outro apresentado como setas na
Figura 3A e B mostraram os modelos de interação 3D dos complexos ivermectina B1a-SARS-CoV-2 replicase e complexos ivermectina B1b-replicase. Os valores do fator B revelaram a amplitude relativa dos deslocamentos atômicos em torno do estado de equilíbrio e também inferidos via NMA foi equivalente a RMS (
Figura 3 E e F). Enquanto o cálculo da deformabilidade é baseado na distorção individual de cada resíduo, as dobradiças do gráfico representam a região de alta deformabilidade da cadeia (
Figura 3CD). A rigidez do movimento dos átomos Cα calculada através do valor próprio juntamente com o modelo de modo normal verificado, o valor próprio mais baixo indica que mais fácil é a deformação, pois é necessária uma energia menor para deformar a estrutura complexa. Os respectivos valores próprios para o complexo ivermectina B1a-SARS-CoV-2 replicase e o complexo ivermectina B1a-SARS-CoV-2 replicase foram 2,179033 × 10 -4 e 7,466426 × 10 -7 , respectivamente, que indicaram estabilidade muito alta do complexos (
Figura 3 G e H). A variância aliada a cada modo normal (aqui foram selecionados 20 modos normais para cálculo) que é inversamente relacionada ao valor próprio, as variâncias individuais representadas pelas cores vermelhas e as variâncias cumulativas indicadas pela cor verde são mostradas na
Figura 3I e J. A matriz de covariância mostrou a ligação entre pares de resíduos, como as cores vermelho, verde e azul indicam os pares correlacionados, não correlacionados e anticorrelated de resíduos, respectivamente, mostrado na
Suplementar Figura 4A & B . Enquanto um gráfico de rede elástica representa os pares de átomos conectados por molas e cada ponto no gráfico caracteriza uma mola entre o par de átomos correspondente. No gráfico, mais escuras cinzas especificar fontes mais duras mostrados na
Suplementar Figura 4C & D .
Figura 3. Análise de simulação de dinâmica molecular das interações ivermectina-replicase e ivermectina-RNA-polimerase dependente de RNA.
Resultados da simulação de dinâmica molecular de ivermectina e replicase SARS-CoV-2 e ivermectina e proteína RDRP, respectivamente (A & B) mobilidade NMA, (C & D) deformabilidade, (E & F) fator B, (G & H) valores próprios, variância (I e J) (a cor vermelha assinala as variâncias individuais e a cor verde indica as variâncias cumulativas).
RDRP: RNA polimerase dependente de RNA.
Comparando a eficácia da ivermectina com hidroxicloroquina e remdesivir
Uma vez que a formulação farmacológica sintética da ivermectina consiste essencialmente em uma mistura de dois homólogos - Ivermectina B 1a (≥80%) e B 1a (≤20%), verificamos os efeitos dos homólogos na mistura e separadamente (
Tabela 2 ). Nossos dados indicaram que o homólogo B1b é mais eficaz do que B1a. Além disso, comparamos a eficácia in silico da ivermectina com hidroxicloroquina e remdesivir em termos de ligação às proteínas-chave envolvidas na patogênese da SARS-CoV-2 (
Tabela 2 ). Nossos dados de docking molecular sugerem que a ivermectina possui um potencial melhor do que o remdesivir para se ligar à proteína spike, RBD, subunidade S2 e RDRP de SARS-CoV-2 (
Tabela 2) No entanto, descobriu-se que a hidroxicloroquina tem a afinidade de ligação mais alta em comparação com a ivermectina e o remdesivir (
Tabela 2 ). Curiosamente, descobriu-se que a ivermectina é o melhor composto na ligação à replicase viral (
Tabela 2 ). A ivermectina-hACE2 foi inferida como a ligação mais fraca em comparação com a hidroxicloroquina e remdesivir. Por outro lado, a interação da ivermectina com o TMPRSS2 humano foi superior à do remdesivir, mas inferior à da hidroxicloroquina (
Tabela 2 ). Estudos de dinâmica de simulação comparativa apoiaram ainda mais as inferências extraídas do estudo de docking molecular e iluminou a ivermectina como um potencial composto anticorrosão (
Figura 4 ).
Tabela 2. Eficiência de ligação comparativa de ivermectina, remdesivir e hidroxicloroquina contra as proteínas-chave envolvidas na patogênese da SARS-CoV-2.Proteína alvoE Tot - valor
IvermectinaRemdesivir
† HCQ
B1aB1b SARS-CoV-2
Proteína de pico SARS-CoV-2 -261,74 -287,0 -245,5 -812,00
Domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2 Spike S1 -372,99 -395,9 -353,1 +378,8
Subunidade SARS-CoV-2 Spike S2 -393,29 -411,6 -340,8 -1301,2
Protease principal SARS-CoV-2 -384,56 -408,6 -320,2 -981,8
Replicase SARS-CoV-2 NSP9 -327,47 -352,2 -312,55 +145,9
SARS-CoV-2 RNA-dependente de RNA polimerase -365,52 -428,6 -329,9 -1087,4
Humano
Proteína receptora ACE2 -81,85 -91,4 -79,9 -1360,8
TMPRSS2 -392,75 -382,9 -313,30 -564,6
† Hidroxicloroquina.
Figura 4. Análise de simulação de dinâmica molecular comparativa das interações de ivermectina, hidroxicloroquina e remdesivir com as proteínas virais, ACE2 e TMPRSS2 humanos. Dinâmica de ligação de isômeros de ivermectina e remdesivir ao S1 RBD viral.
Energia de ligação de ivermectina B1b
Determinamos a energia livre de ligação de ivermectina B1b contra RDRP, pois RDRP parece ser o alvo mais eficaz da ivermectina. A energia livre de ligação no mesmo bolso de RDRP com Ivm B1b é -9,67 kcal / mol e a afinidade de ligação calculada Kd é 76,89 nM (nanomolar).
Análise comparativa dos atributos farmacocinéticos de ivermectina, hidroxicloroquina e remdesivir
A análise do perfil ADME-Tox revelou que todos os fármacos têm resposta negativa à inibição do citocromo P450 e da glicoproteína p e positiva à absorção intestinal humana. O valor de lipofilicidade da ivermectina foi de 5,74, o que parece ser ideal para absorção e permeação. A permeabilidade da pele (logK p é -7,14 cm / s) foi considerada a mais alta, enquanto outra propriedade farmacológica importante - semelhança do medicamento, estava em paridade com o remdesivir e melhor do que a hidroxicloroquina (
Tabela Suplementar 2 ).
Discussão
A ivermectina é uma escolha popular de medicamento para o tratamento de várias infecções parasitárias até hoje. Desde 1987, esse medicamento tem sido usado para tratar mais de 3,7 bilhões de pacientes com oncocercose por meio do Programa de Doação de Mectizan, patrocinado pela Merck, para a eliminação da oncocercose [
20 ]. Além disso, a filariose linfática foi incluída neste programa em 1998 [
21 ]. A ivermectina também é um membro da terapia combinatória de três drogas ao lado do albendazol e da dietilcarbamazina [
22 ]. A ivermectina também é eficaz contra Strongyloides , sarna e helmintos transmitidos pelo solo [
24 ]. A ivermectina exerce sua ação parasiticida através da ligação e bloqueio do ânion / Cl -
23 ]. Além disso, a ivermectina também foi explorada como um endectocida para reduzir os vetores da malária para reduzir a transmissão da doença [
canais íon localizados na membrana celular, causando a ruptura do sistema neuromuscular levando à paralisia e morte [
23 ]. Uma grande vantagem de usar este medicamento aprovado pela FDA é sua natureza relativamente benigna em doses de tratamento em humanos [
25 ]. Recentemente, a ivermectina foi relatada para atividade antiviral para SARS-CoV-2 in vitro [
13 ]. O estudo descreve que uma dose baixa de ivermectina (5 micromolar) pode induzir uma redução de 93% no RNA viral do vírion liberado e uma redução de 99,8% no vírion associado / não liberado à célula após 24 h de incubação [
13] Curiosamente, descobriu-se que a redução do RNA viral aumentou em até 5.000 vezes após 48 horas de tratamento [
13 ]. Os pesquisadores levantaram a hipótese de que a ivermectina se liga e prejudica o heterodímero Impα / β1, que desempenha um papel fundamental na ligação da proteína de carga do coronavírus e facilita sua translocação em direção ao núcleo [
13 ]. Além disso, os pesquisadores também afirmam que as moléculas de ivermectina podem atuar como ionóforos e ser capazes de produzir lise osmótica da membrana viral [
26 ]. Considerando a alta e rápida atividade viricida da ivermectina, o envolvimento de um alvo específico é uma questão. Portanto, o presente estudo foi realizado in silico. para explorar os possíveis alvos moleculares da ivermectina no SARS-CoV-2 e o possível mecanismo de interações entre a ivermectina e o proteínas envolvidas na patogênese viral. Essas interações moleculares entre a ivermectina e as proteínas-alvo estão provavelmente mediando a eficácia antiviral rápida e intensa da ivermectina.
A glicoproteína de pico tem sido a principal molécula viral envolvida na ligação ao receptor da superfície da célula hospedeira e no estabelecimento da infecção [
1 ]. Nossos dados de docking molecular e contra verificação por simulação dinâmica molecular evidenciaram coletivamente que a ivermectina tem como alvo a subunidade S2 da proteína spike e pode causar alteração conformacional, que pode interferir na interação proteína spike-ACE2 (
Figura 1 A,
Tabela 1 e
Tabela 1 suplementar ). O SARS-CoV-2 usa uma enzima protease, ou seja, protease semelhante à quimiotripsina (3CLpro) ou protease principal (Mpro), que desempenha uma função importante para iniciar a ligação mediada pela proteína spike ao ACE2 humano e a entrada do vírus [
3] Aqui, verificamos a interação entre a ivermectina e a protease viral e encontramos uma forte interação hidrofóbica entre as duas (
Figura 1 B e
Tabela 1 ). Curiosamente, a eficácia de ligação da ivermectina à replicase / RDRP SARS-CoV-2 foi considerada relativamente alta (
Figura 2 A – B e
Tabela 1 ). Na verdade, a ivermectina foi considerada a melhor das três drogas na ligação com a replicase viral (
Tabela Suplementar 2) Tomando pistas da hipótese sobre o efeito da ivermectina nos alvos virais, verificamos ainda se a ivermectina poderia ter qualquer interação com os parceiros relacionados presentes no ser humano. Estudos anteriores sobre a patogênese viral demonstraram a importância do receptor ACE2 humano e das proteínas TMPRSS2 e, por essa razão, o efeito da ivermectina nesses dois alvos foi estudado. Documentamos uma ligação relativamente fraca do isômero ivermectina B1A com ACE2 a partir do estudo biocomputacional (
Figura Suplementar 3 ), orquestrada principalmente pelos resíduos de Asn61 e Asn64 em ACE2 (
Tabela Suplementar 1 ). No entanto, verificou-se que o isômero ivermectina B1B exerce forte ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica com o receptor ACE2 humano (
Tabela Suplementar 1) Esses dados são encorajadores, pois o ACE2 medeia várias funções fisiológicas importantes no corpo humano, incluindo a regulação da pressão sanguínea e, portanto, um efeito neste receptor pode induzir desequilíbrio fisiológico grave. No entanto, a ivermectina se ligou ao TMPRSS2 com melhor afinidade e estabilidade (
Figura 2 C).
Recentemente, a hidroxicloroquina foi testada quanto à eficácia contra SARS-CoV-2 [
11 ] e foi relatado que inibe a função da proteína spike por meio da ligação com o resíduo de ácido siálico do gangliósido de membrana [
27 ]. Por outro lado, o remdesivir também surgiu como outra escolha de medicamento para o tratamento de pacientes coronais graves e relatou inibir a replicação do SARS-CoV-2 por meio da ligação direta com o RDRP viral [
28 ]. Mas, isso in silicoO estudo é um relatório inaugural para comparar o potencial de ligação relativo dessas duas drogas com a ivermectina e apresentar a ivermectina como um potencial agente anti-SARS-CoV-2 para seu uso generalizado em um futuro próximo. Em um estudo anterior, foi claramente descrito que o efeito inibitório da ivermectina no SARS-CoV-2 é mediado por sua ligação direta aos resíduos do sítio ativo de SARS-CoV-2 RdRp, como Ser759, Asp760 e -Asp761 que são presente no sítio ativo da enzima [
29] Curiosamente, nossos dados indicaram que a ivermectina se liga forte e estavelmente à replicase viral em comparação com hidroxicloroquina e remdesivir, enquanto a estabilidade dos complexos ivermectina-proteína viral incluindo S1 RBD, proteína S2, RDRP, TMPRSS2 foi considerada melhor do que a de remdesivir. Descobriu-se que a eficácia da ivermectina B1b é maior do que a de seu isômero B1a. Recentemente, estudos sobre a proteômica comparativa de linhagens celulares tratadas com SARS-CoV-2 e SARS-CoV-2 tratadas com ivermectina também apoiaram a ação multitargetada da ivermectina [
30 ,
31 ]. Eweas et al. [
30 ] sugeriu uma forte afinidade de ivermectina para Nfosfoproteína e nsp14, que foi postulado como estando envolvido na inibição da replicação e montagem viral). Um estudo conduzido por Lehrer et al. [
31 ] também forneceram evidências sobre a forte interação da ivermectina com a proteína spike existente em uma forma ligada ao ACE2. Um estudo recente de proteômica quantitativa por Li et al. [
32] revelaram alterações na expressão de 52 proteínas relacionadas com SARS-CoV-2 / COVID-19 em linhagem de células de câncer de ovário após o tratamento com ivermectina e tais alterações nas proteínas induzidas por ivermectina influenciaram o evento de sinalização envolvendo principalmente citocinas e fator de crescimento família, MAP quinase e família de proteína G, e proteínas da classe HLA. Todas essas evidências apoiam os achados do presente estudo, indicando a ivermectina como um antiviral de amplo espectro para o tratamento de COVID-19. Além disso, nosso in silicoanálises dos perfis farmacocinéticos dessas três drogas de interesse também revelaram a ivermectina como uma droga candidata adequada. Em comparação com a hidroxicloroquina e o remdesivir, a ivermectina tem solubilidade em água e lipofilicidade relativamente muito maiores, além disso, por outro lado, tem menor permeação na pele (
Tabela Suplementar 2 ). Os três medicamentos incluídos no estudo são medicamentos aprovados pela FDA e usados no tratamento de várias infecções parasitárias (ivermectina e hidroxicloroquina) e virais (remdesivir) em humanos. No entanto, para apresentar a adequação da ivermectina para o tratamento de COVID-19, comparamos as propriedades farmacológicas da ivermectina com as outras duas drogas.
Tomados em conjunto, nossos dados sobre a interação entre a ivermectina e as proteínas virais indicaram que a ivermectina atua principalmente interferindo na entrada do vírus por meio da inibição da função da proteína spike e da protease. Esses estudos também indicam que a ivermectina também pode ter como alvo o ACE2 e o TMPRSS2 humanos para exercer sua ação inibitória sobre o SARS-CoV-2. No entanto, todos esses estudos in silico requerem validação experimental subsequente, o que poderia permitir que a ivermectina como uma droga de confiança a ser usada para neutralizar o crescimento viral.
Conclusão
O desenvolvimento de uma terapêutica eficaz contra COVID-19 é atualmente o maior interesse para as comunidades científicas. O presente estudo descreve a eficácia de ligação comparativa de um medicamento promissor aprovado pela FDA, ivermectina, contra as principais proteínas patogênicas do SARS-CoV-2 e suas contrapartes humanas envolvidas na interação patógeno-hospedeiro. Aqui, nossos dados in silico indicaram que a ivermectina utiliza eficientemente a proteína spike viral, protease principal, replicase e receptores TMPRSS2 humanos como os alvos mais possíveis para executar sua eficiência antiviral. Portanto, a ivermectina explora alvos proteicos de vírus e humanos, o que poderia ser a razão por trás de sua excelente eficácia in vitro contra SARS-CoV-2, conforme relatado por Caly et al. [
13] Verificou-se que os isômeros da ivermectina B1b são a molécula mais eficaz dentre os dois homólogos. Curiosamente, a comparação da eficiência in silico da ivermectina com os medicamentos anticorrosona usados atualmente, como a hidroxicloroquina e o remdesivir, indicou o potencial da ivermectina em atingir as principais proteínas patogênicas da SARS-CoV-2. A ivermectina é um medicamento antiparasitário popular e também é seguro em crianças, adultos jovens, mulheres grávidas e lactantes. O desenvolvimento da liberação pulmonar de ivermectina por meio da síntese de uma melhor formulação de ivermectina foi relatado recentemente e espera-se que isso encurte a duração do tratamento e leve a melhores resultados [
33] É digno de nota mencionar que muitos anti-SARS-CoV-2s estão agora sendo testados quanto à sua eficácia na formação da resposta imune de humanos, por meio do direcionamento da superfície celular, bem como de receptores intracelulares semelhantes a toll [
34 ,
35 ]. Nesse contexto, a ivermectina também pode ser uma opção eficaz. Considerando todos esses fatos, o presente estudo explora os alvos terapêuticos da ivermectina contra a SARS-CoV-2 e ilumina a possibilidade do uso desse medicamento em ensaios clínicos com COVID-19 em breve.
Pontos de resumo
O presente estudo in silico apresenta a eficácia terapêutica da ivermectina contra a SARS-CoV-2 em comparação com dois fármacos anti-SARS-CoV-2 recentemente utilizados, o remdesivir e a hidroxicloroquina.
O docking molecular foi realizado usando as drogas de interesse e várias proteínas envolvidas no ciclo de infecção de SARS-CoV-2, como glicoproteína de pico, protease principal, replicase, RNA polimerase dependente de RNA, receptor ACE2 humano e serina protease transmembrana humana. A dinâmica da interação foi posteriormente analisada por estudos de simulação de dinâmica molecular e a energia livre de ligação da ivermectina a cada proteína foi determinada.
Os atributos farmacocinéticos da ivermectina foram comparados com outros dois medicamentos anti-SARS-CoV-2 e a ivermectina foi considerada um medicamento seguro.
A ivermectina foi considerada um inibidor eficiente de Mpro, replicase e hTMPRSS2 e o estudo manifesta uma base superior para a candidatura da ivermectina a ser uma opção terapêutica anti-SARS-CoV-2 eficiente.
Dados suplementares
Para ver os dados suplementares que acompanham este artigo, visite o site da revista em:
www.futuremedicine.com/doi/suppl/10.2217/fvl-2020-0342Contribuições do autor
A Choudhury, NC Das e R Patra realizaram todos os experimentos; A Choudhury, M Bhattacharya e S Mukherjee analisaram os dados e escreveram o manuscrito: NC Das, R Patra, P Ghosh e BC Patra editaram o rascunho; S Mukherjee finalizou o manuscrito, elaborou e supervisionou o estudo.
Agradecimentos
Os autores agradecem os esforços de todos os médicos, profissionais de saúde, cientistas e pesquisadores atualmente envolvidos no tratamento e na pesquisa do COVID-19. R Patra agradece Departamento de Educação Superior, Govt. de West Bengal por sua bolsa de mérito e meios. Eles incorporaram um certo número de referências devido à limitação de espaço de ter um respeito prodigioso a todos os artigos relacionados não citados sobre o Coronavirus.
Divulgação de interesses financeiros e concorrentes
Todos os autores leram e aprovaram a submissão. Este manuscrito foi submetido exclusivamente a esta revista. Os autores não têm afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito. Isso inclui empregos, consultorias, honorários, propriedade de ações ou opções, depoimentos de especialistas, concessões ou patentes recebidas ou pendentes, ou royalties.
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Conduta ética de pesquisa
Este artigo não contém quaisquer estudos com participantes humanos ou animais realizados por qualquer um dos autores.
Disponibilidade de dados e material
Disponível com o autor correspondente a pedido.
Por Ethan Huff HAF 22 De Março De 2021 
Por 
26 de março de 2021
