Em resposta a materia do postagem anterior sobre o assunto no blog.
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Figuras
Citação: Chan WFN, Gurnot C, JT Montine, Sonnen JA, Guthrie KA, Nelson JL (2012) Microchimerism Masculino no Cérebro Feminino Humano. PLoS ONE 7 (9): e45592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592
Editor: Martin Gerbert Frasch, Université de Montréal, Canadá
Recebido: 30 de abril de 2012; Aceito em 23 de agosto de 2012; Publicado em: 26 de setembro de 2012
Direitos autorais: © Chan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição da Creative Commons, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados.
Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NS 071418 e AI-41721 para JLN). A WFNC foi apoiada pelo Instituto Canadense de Bolsas de Pesquisa em Saúde (SIB-95173). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Interesses concorrentes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Introdução
Durante a gravidez, o material genético e as células são trocados bidirecionalmente entre o feto e a mãe [1] , após o que pode haver persistência das células estranhas e / ou DNA no receptor [2] , [3] . Este microquimerismo adquirido naturalmente (Mc) pode transmitir efeitos benéficos ou adversos à saúde humana. O Fetal Mc, que descreve a persistência de células e / ou DNA de origem fetal na mãe adquirida durante a gravidez, tem sido associado a várias doenças auto-imunes, bem como implicado na reparação tecidual e na vigilância imunológica [4] - [6] .
Embora exista uma ampla distribuição anatômica de Mc em humanos que varia em prevalência e quantidade [7] - [13] , se o cérebro humano abriga Mc fetal e com que frequência não é conhecida. O Fetal Mc foi recentemente descrito no cérebro do rato [14] , [15] . Em estudos limitados, o Mc materno foi descrito no cérebro fetal humano [9] .
Neste estudo, foi realizada PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para detectar e quantificar o DNA masculino em múltiplas regiões cerebrais de mulheres, visando a seqüência do gene DYS14 específico do cromossomo Y como um marcador para Mc de origem fetal. Indivíduos femininos falecidos não apresentavam evidências clínicas ou patológicas de doença neurológica. Também testamos espécimes cerebrais de mulheres com doença de Alzheimer (DA) para Mc. Isso ocorre porque a DA foi relatada como mais prevalente em mulheres pardas vs. nulíparas [16] , [17] , aumentando com o maior número de gestações que também se correlacionaram com uma idade mais jovem de início da DA [17] , [18] .
Métodos
Sujeitos e Espécimes
Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson (Número 5369; Protocolo 1707). Os sujeitos do estudo eram mulheres sem doença neurológica ou com DA, totalizando 59 indivíduos falecidos. Vinte e seis mulheres não tinham doença neurológica. Trinta e três mulheres apresentavam DA ( Tabela 1). Os espécimes de autópsia cerebral dessas mulheres vieram de uma das duas instituições: o Departamento de Patologia da Universidade de Washington em Seattle, Washington, ou o Centro de Recursos para Tecido Cerebral de Harvard estabelecido no McLean Hospital em Belmont, Massachusetts. Espécimes da Universidade de Washington foram obtidos de mulheres adultas que não tinham história clínica de doença neurológica dentro de dois anos de morte e cuja histologia cerebral não mostrou evidência de doença, e de mulheres que foram diagnosticadas com provável AD durante a vida [19] e conheceram os critérios de consenso do Instituto Nacional sobre o Instituto Aging-Reagan para um diagnóstico neuropatológico da DA [20]. Da mesma forma, espécimes do Centro de Recursos de Tecido Cerebral de Harvard foram obtidos de mulheres adultas sem doença neurológica ou que preencheram critérios clínicos e patológicos para DA. A idade de óbito variou de 32 a 101 anos ( Tabela 1). A idade no início da doença era conhecida por indivíduos com DA da Universidade de Washington (mediana: 77 anos; intervalo: 64-93 anos). Após a autópsia, as amostras cerebrais foram fixadas em formol ou congeladas em nitrogênio líquido. Dependendo da disponibilidade, amostras de duas a doze regiões cerebrais foram obtidas de cada indivíduo. As regiões cerebrais investigadas incluíram lobo frontal, lobo parietal, lobo temporal, lobo occipital, giro cingulado, hipocampo, amígdala, caudado, putâmen, globo pálido, tálamo, medula, ponte, cerebelo e medula espinhal. Indivíduos com AD contribuíram com mais espécimes por pessoa do que indivíduos sem doença neurológica, mas isso não foi estatisticamente significativo (significa: 3,6 vs. 2,5, respectivamente; p = 0,05). Combinando os sujeitos de ambas as instituições, os sujeitos com DA eram significativamente mais velhos no momento da morte (p <0,001);Tabela 1 ) A fonte mais provável de Mc masculino no cérebro feminino é a aquisição de DNA masculino por uma mulher a partir de uma gravidez com um feto masculino. História limitada de gravidez estava disponível sobre os sujeitos; história de gravidez na maioria dos assuntos era desconhecida. Nove mulheres eram conhecidas por terem pelo menos um filho, oito com DA e uma sem doença neurológica. Duas mulheres não tinham história de ter filhos, uma com DA e outra sem doença neurológica.
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Tabela 1. Características de pacientes do sexo feminino sem doença neurológica ou com doença de Alzheimer.
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Extração de DNA
O ADN genómico foi extraído dos tecidos do cérebro utilizando o kit QIAamp® DNA Mini (QIAGEN, Valência, CA), de acordo com o protocolo de fabrico do tecido.
QPCR em tempo real
O DNA masculino foi quantificado em tecido cerebral feminino por amplificação da sequência específica do cromossoma Y DYS14 (GenBank Accession X06325) [21] utilizando o ensaio TaqMan® e o sistema de detecção de sequências ABI Prism® 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sequências de primers e sonda para quantificação de DYS14 [22] , bem como preparação de curvas padrão, composição da mistura de qPCR e perfil térmico [23]Todos foram descritos anteriormente. O quadrado do coeficiente de correlação para todas as curvas padrão foi sempre maior que 0,99. Cada experimento não incluiu controles modelo para testar a contaminação do DNA masculino durante a instalação da placa e todos os controles foram negativos. Um mínimo de seis poços foi testado para cada amostra. A média da Ct foi de 36, com um intervalo entre 30 e 39 para todos os espécimes, exceto os do B6388, que estava entre 26 e 29. Um gráfico de amplificação representativo é fornecido na ( Figura S1). Apenas poços nos quais a amplificação ocorreu em Ct <40 foram usados para calcular a concentração de Mc. Em um poço individual, a quantidade de DNA sujeito a qPCR não excedeu o equivalente a 3,5 × 10 4genomas (um genoma é aproximadamente igual a 6,6 pg de DNA), pois isso poderia inibir a amplificação. A quantidade média de ADN em cada poço testado foi determinada por amplificação concorrente da sequência de globina beta em poços em duplicado separados (sequências de iniciador e sonda descritas anteriormente [24] excepto que o repórter FAM foi substituído por VIC). A concentrao final de Mc masculino foi expressa como o nero de equivalentes genicos masculinos (gEq) de ADN que seriam detectados num espime contendo o equivalente de 1 x 10 5 genomas totais (gEq / 10 5 ). O gEq total testado por amostra não diferiu entre os dois grupos (medianas: 1,3 × 10 5 vs. 1,5 × 10 5 ; p = 0,50). Porque DYS14é um gene multi-cópia [21] e nosso ensaio qPCR altamente sensível, e devido à possibilidade de contaminação cruzada de espécimes por DNA masculino de origem desconhecida antes da extração do DNA (ou seja, durante a colheita e manipulação de amostras) ou da configuração qPCR, avaliaram a positividade dos resultados de forma mais conservadora aplicando critérios adicionais: 1) a amplificação ocorreu em pelo menos dois poços dentro de um único experimento; e 2) a concentração total de Mc masculino foi> 0,5 gEq / 10 5 . Assim, estimativas de Mc masculino podem ser menores que os valores verdadeiros. Por outro lado, como a detecção do DNA masculino não foi responsável por Mc potencialmente contribuída por fetos femininos, isso poderia resultar na subestimação do Mc total no cérebro. QPCR específico para HLA, conforme relatado anteriormente [25] ,[26] , é outra abordagem para detecção de Mc que não é dependente de sexo. Requer participação de familiares que não foi possível para os estudos atuais. Como um estudo suplementar, nós testamos cérebro autopsiado de uma paciente com esclerose sistêmica feminina por qPCR específica para HLA para quem tivemos genotipagem familiar de HLA, visando HLA paternalmente transmitido da criança como descrito anteriormente [26] , [27] . Esses dados são fornecidos em ( Tabelas S1 e S2 ). Todos os dados qPCR foram analisados usando o 7000 System Sequence Detection Software.
Estatisticas
As características de sujeito e Mc foram comparadas entre os grupos pelo teste do qui-quadrado para dados categóricos e teste t para dados contínuos. A prevalência e as concentrações de Mc foram analisadas de acordo com o estado da doença. Um modelo de regressão logística foi utilizado para estimar a associação entre a prevalência de Mc e o status da doença, com ajuste para o total de gEq testado, idade ao óbito e PMI. As estimativas também foram ajustadas para possível correlação entre medidas repetidas do mesmo sujeito por meio de equações de estimativas generalizadas. A associação foi relatada como odds ratio (OR), juntamente com o valor de p para indicar significância. Como exemplo, OR de 0,30 poderia ser interpretado para dizer que as chances de ter DA para um sujeito que testou positivo para Mc foi 70% menor do que as chances de um sujeito que testou negativo. Também analisamos as concentrações de Mc como o resultado em modelos de regressão log-linear de Poisson, assumindo que o número de gEq detectado como Mc foi diretamente proporcional ao número de gEq total testado. Por definição, Mc ocorre raramente, portanto, a distribuição de dados é inclinada para a direita. Utilizamos modelos binomiais negativos para explicar o alto grau de super dispersão nos dados; A interpretação das estimativas resultantes é idêntica à de um modelo de Poisson. Ajustes para potenciais confundidores e para possível correlação entre medidas repetidas foram feitos como descrito acima. A razão da taxa (RR), juntamente com o valor p para indicar significância, foi usada para comparar as taxas observadas de detecção de Mc nos dois grupos. Por exemplo, RR de 0. 30 poderia ser interpretado para dizer que a taxa de detecção de Mc em indivíduos com DA foi 70% menor do que a taxa de detecção de Mc em indivíduos sem doença neurológica. A análise secundária foi conduzida para determinar se o estado da doença estava associado com a prevalência ou concentração de Mc em um subconjunto de amostras de regiões do cérebro consideradas mais afetadas pela DA. Além disso, investigamos se a prevalência ou concentração de Mc correlacionou-se com o estágio de Braak, que descreve a extensão dos emaranhados neurofibrilares em indivíduos com DA.[28] , ou com o HLA-DRB1 * 1501, um alelo de antígeno leucocitário humano que foi relatado em associação com DA [29] . Os valores de p de dois lados dos modelos de regressão foram derivados do teste de Wald. As análises foram realizadas no software SAS versão 9 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).
Resultados
Prevalência Mc e concentração de acordo com as regiões do cérebro
A mediana do número de amostras testadas por indivíduo foi de três, com um intervalo de um a 12. A Tabela 2 resume a prevalência do nível de espécime do Mc masculino de acordo com a região do cérebro para todos os indivíduos. Por região do cérebro, entre dois e 35 espécimes foram testados para o DNA masculino. Embora houvesse poucos exemplares disponíveis, não detectamos DNA masculino no lobo frontal e no putâmen, e encontramos a maior prevalência na medula oblonga. Considerando todos os sujeitos em conjunto, as concentrações variaram Mc 0-512,5 GEQ / 10 5 , com um valor médio de 0,2 e um 90 th percentil de 3,7 GEQ / 10 5 ( Figura 1). Um sujeito do Harvard Brain Tissue Resource Center que estava sem doença neurológica (codificada como B6388; idade de morte de 69 anos) tinha três amostras com os maiores valores de concentração em nosso conjunto de dados (296,1, 481,8 e 512,5 gEq / 10 5 no temporal lobo, giro do cíngulo e ponte, respectivamente). Usando hibridização in situ porfluorescência, de fato encontramos células masculinas raras no cérebro de B6388 ( Figura S2). Os valores de concentração restantes no conjunto de dados foram de 29,4 gEq / 10 5 ou menos. Em relação à relação entre a história de gravidez e a prevalência de Mc, cinco dos nove indivíduos que sabiam ter pelo menos um filho tinham Mc masculino em pelo menos uma das regiões do cérebro ( Tabela S3).). Todos os indivíduos positivos tinham DA; entre os negativos, três com DA e um sem doença neurológica. Uma das duas mulheres sem histórico de ter filhos também foi positiva para Mc masculino em seu cérebro e sem doença neurológica; o indivíduo negativo tinha DA.
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Figura 1. Concentração de Mc masculino nas regiões do cérebro humano feminino.
Espécimes cerebrais autopsiados de fêmeas sem qualquer doença neurológica (círculos abertos) ou com AD (círculos preenchidos) foram testados por qPCR para DNA masculino. Cada ponto representa um espécime cerebral único. O telencéfalo consiste em regiões neocorticais (lobos frontal, parietal, temporal e occipital), regiões límbicas (hipocampo, amígdala e giro do cíngulo) e regiões dos gânglios da base (putâmen, caudado e globus pallidus). O diencéfalo consiste em tálamo. O rombencéfalo consiste em medula, ponte e cerebelo. Devido ao maior número de pontos de dados coletados para telencéfalo e rombencéfalo, os dados para cada grupo foram plotados lado a lado para melhor apresentar suas distribuições. Tal separação não foi feita nos dados para diencéfalo e medula espinhal.
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Tabela 2. Prevalência de Mc masculino em regiões individuais do cérebro em mulheres sem doença neurológica ou com doença de Alzheimer.
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Prevalência e Concentração de Mc Masculino no Cérebro Humano: Mulheres sem Doença Neurológica ou com DA
Dos 183 espécimes, 64 (35%) deram positivo para Mc ( Tabela 2). Dezoito dos 26 indivíduos sem doença neurológica (69%) apresentaram pelo menos um valor positivo, com 30 resultados positivos em 65 espécimes (46%). Dezenove dos 33 indivíduos com DA (58%) tiveram pelo menos um valor positivo, com 34 resultados positivos em 118 espécimes (29%). A OR estimada de um modelo univariado foi de 0,47 (intervalo de confiança de 95% (IC) 0,21-1,08, p = 0,08). Após ajuste para o total de gEq testado, idade ao óbito e PMI, a DA foi significativamente associada com menor prevalência de Mc: OR 0,40 (IC 95% 0,17-0,93, p = 0,03). Assim, as chances de ter DA para um sujeito que testou positivo para Mc foi 60% menor do que as chances de um sujeito que testou negativo. Quando as concentrações de Mc foram analisadas de acordo com os indivíduos sem doença neurológica ou com DA, o RR estimado de um modelo ajustado foi de 0,05 (IC 95% 0,01-0,39, p = 0,004). Contudo, a exclusão de espécimes cerebrais do sujeito B6388, que estava sem doença neurológica e cujo nível de Mc masculino era 10 vezes maior do que a concentração mais alta seguinte de um indivíduo diferente, modificou dramaticamente a estimativa: RR 0,41 (IC 95% 0,16–1,05, p = 0,06). Assim, a taxa de detecção de Mc em indivíduos com DA foi 59% menor do que a taxa de detecção de Mc em indivíduos sem doença neurológica, mas não foi estatisticamente significativa. A idade ao óbito também não foi estatisticamente significativamente associada à prevalência de Mc, seja em modelos univariados ou ajustados (ajustes para o status da doença e gEq total testado; p = 0,79). Contudo,
Prevalência e Concentração de Mc Masculino em Regiões Cerebrais Afetadas pela DA
Realizamos uma análise secundária considerando apenas espécimes das cinco regiões cerebrais consideradas mais afetadas pela DA: amígdala, hipocampo, lobo frontal, lobo parietal e lobo temporal [30] , [31]. Considerando apenas essas regiões, 12 de 24 indivíduos sem doença neurológica (50%) apresentaram pelo menos um valor positivo, com 12 resultados positivos em 24 espécimes (50%). Treze dos 33 indivíduos com DA (39%) tiveram pelo menos um valor positivo, com 15 resultados positivos em 44 espécimes (34%). A OR ajustada descrevendo a associação entre a prevalência de Mc e o estado da doença foi de 0,48 (IC 95% 0,14-1,62, p = 0,23). Portanto, a probabilidade de ter DA para um sujeito que testou positivo para Mc nas regiões do cérebro mais afetadas por essa doença foi 52% menor do que a probabilidade de um sujeito ter resultado negativo, mas não foi estatisticamente significativo. No entanto, nenhum dos indivíduos sem doença neurológica contribuiu com espécimes da amígdala ou do lobo frontal. Comparando as concentrações de Mc entre os grupos, excluindo um espécime do sujeito B6388, o RR ajustado foi 0. 27 (IC 95% 0,13-0,56, p <0,001). Assim, a proporção de espécimes positivos não foi significativamente diferente entre os grupos, mas as concentrações de Mc neste subconjunto de amostras cerebrais de indivíduos com DA tenderam a ter valores mais baixos do que os encontrados em indivíduos sem doença neurológica. Em outras análises, não houve associação significativa entre a prevalência ou concentração de Mc e o estágio de Braak (Tabela 1 ; p = 0,99 e 0,93, respectivamente) e não houve associação significativa entre a prevalência de Mc e HLA-DRB1 * 1501 (8 de 11 indivíduos portadores de DR15 positivos para Mc (73%) versus 16 de 31 indivíduos sem DR15 que também tinham Mc ( 52%), p = 0,13).
Discussão
Neste estudo, fornecemos a primeira descrição do Mc masculino no cérebro humano feminino e nas regiões cerebrais específicas. Coletivamente com dados que mostram a presença de DNA masculino no líquido cefalorraquidiano [32] , nossos resultados indicam que o DNA fetal e as células prováveis podem atravessar a barreira hematoencefálica humana (BHE) e residir no cérebro. Alterações na permeabilidade da BHE ocorrem durante a gravidez [33] e podem, portanto, proporcionar uma oportunidade única para o estabelecimento de Mc no cérebro. Também único para o nosso estudo são as descobertas que o Mc masculino no cérebro humano feminino é relativamente frequente (positivo em 63% dos indivíduos) e distribuído em múltiplas regiões cerebrais, e é potencialmente persistente ao longo da vida humana (a fêmea mais velha na qual o DNA masculino foi detectado no cérebro foi de 94 anos).
O fato de Mc poder penetrar na BHE humana e residir no cérebro foi indicado pela primeira vez por estudos murinos que mostraram a presença de células estranhas e DNA em cérebros de camundongos [14] , [15] . No entanto, a prevalência de Mc cerebral em camundongos não foi bem definida, já que a freqüência relatada varia dependendo do estudo [14] , [15] , [34] - [36] , e em uma investigação, Mc não foi observada [37 ]. Semelhante aos dados do rato, o nosso estudo em humanos descobriu que o cérebro Mc não estava presente em todos os indivíduos testados. Mesmo naqueles que mostraram positividade geral, nem todas as regiões do cérebro tinham Mc. A concentração de Mc também mostrou uma variabilidade considerável. Em geral, nossos dados complementam e se estendem a outros relatos descrevendo Mc na população humana geral, no sangue periférico e no nível do tecido / órgão estudado dentro e entre os indivíduos [9] - [13] . Atualmente, não é possível comparar significativamente a prevalência ou a concentração de Mc no cérebro humano a outros tecidos porque outros tecidos não estavam disponíveis em nossos pacientes. Além disso, estudos prévios que avaliavam Mc em outros órgãos utilizavam diversos métodos, alguns dos quais não eram quantitativos.
A fonte mais provável de Mc masculino no cérebro feminino é a aquisição de Mc fetal da gravidez com um feto masculino. Nas mulheres sem filhos, o DNA masculino também pode ser adquirido por aborto ou aborto espontâneo [22] , [23] , [38] - [40] . A história de gravidez era desconhecida para todos, mas alguns indivíduos nos estudos atuais, assim, Mc masculino no cérebro feminino não pôde ser avaliado de acordo com a história específica de gravidez anterior. Além de gestações anteriores, o Mc masculino poderia ser adquirido por uma fêmea de um gêmeo masculino reconhecido ou desaparecido [41] - [43] , um irmão mais velho do sexo masculino ou por transfusão de sangue não irradiado [44] .
Como a DA é mais prevalente em mulheres do que em homens e um risco aumentado foi relatado em mulheres pardas vs. nulíparas e correlacionado com a idade mais jovem de início [16] - [18] , também investigamos Mc masculino em mulheres com DA. A DA é uma doença neurodegenerativa caracterizada por níveis elevados de placas amiloides, amiloidose cerebrovascular e emaranhados neurofibrilares [30]. Nossos resultados que sugerem mulheres com DA têm uma menor prevalência de Mc masculino no cérebro e concentrações mais baixas nas regiões mais afetadas pela DA foram inesperadas. No entanto, o número de indivíduos testados foi modesto e, como discutido anteriormente, a história da gravidez era em grande parte desconhecida. A explicação para diminuição de Mc na DA, caso essa observação seja replicada em um estudo maior, não é óbvia. Em outras doenças, ambos os efeitos benéficos e prejudiciais de Mc de origem fetal foram descritos dependendo de vários fatores, incluindo o tipo específico e fonte de Mc [6] . Uma limitação significativa do presente estudo foi a incapacidade de distinguir o tipo e a fonte do Mc masculino, e estudos adicionais que distinguem o geneticamente normal do Mc anormal seriam de interesse potencial.
Atualmente, o significado biológico de abrigar Mc no cérebro humano requer mais investigação. Mc parece persistir no sangue, osso e medula óssea por décadas [2] , [45] e está presente entre diferentes linhagens hematopoiéticas [46] . Além disso, Mc parece integrar e gerar tipos celulares específicos em tecidos [10] , [11] , [47] - [49] . Em estudos murinos, observa-se que a Mc fetal no cérebro materno se parece com macrófagos perivasculares, neurônios, astrócitos e oligodendrócitos morfológica e fenotipicamente e ocupa os respectivos nichos [15] , [36]. Assim, é possível que Mc no cérebro seja capaz de se diferenciar em vários fenótipos maduros ou sofrer fusão com células pré-existentes e adquira um novo fenótipo, como sugerido por estudos em humanos e murinos em que células derivadas da medula óssea circulavam no cérebro. e gerou células neuronais por diferenciação, ou fundidas com neurônios preexistentes [50] - [53] . Por fim, alguns estudos relataram uma associação entre paridade e diminuição do risco de câncer cerebral, levantando a possibilidade de que Mc pudesse contribuir para a imunovigilância contra células tumorigênicas, como tem sido sugerido para alguns outros tipos de malignidade [6] , [54] - [56 ] .
Em conclusão, o Mc masculino é frequente e amplamente distribuído no cérebro humano feminino. Embora a relação entre o cérebro Mc e saúde versus doença requer mais estudos, nossos resultados sugerem que Mc de origem fetal poderia afetar a saúde materna e potencialmente ser de importância evolutiva.
Informações de Apoio
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Gráfico de amplificação DYS14 de uma amostra representativa do cérebro. É mostrado o gráfico de amplificação de uma amostra do cíngulo de uma fêmea com DA.
Figura S1.
Gráfico de amplificação DYS14 de uma amostra representativa do cérebro. É mostrado o gráfico de amplificação de uma amostra do cíngulo de uma fêmea com DA.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592.s001
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Figura S2
Detecção de núcleos masculinos em cérebro feminino por hibridização in situfluorescente. Pontes do sujeito B6388 fixadas em formalina e embebidas em parafina, nas quais o Mc masculino foi quantificado a uma concentração de 512,5 gEq / 10 5por qPCR, foi hibridizado com sondas fluorescentes específicas para os cromossomas X e Y. A secção de tecido foi desparafinizada, reidratada, desnaturada numa solução de ácido fórmico a 44% e peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 15 minutos e incubada numa solução de recuperação de antigénio (Dako, Carpinteria, CA) num vaporizador convencional durante mais de 30 minutos. A desnaturação adicional foi feita usando ácido clorídrico 0,2 N durante 20 minutos. A secção foi lavada com 2x cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) contendo Tween-20 a 0,05%, incubada em 2xSSC a 42 ° C durante 30 minutos e tratada com pepsina (DIGEST-ALL ™ 3, Dako) a 37 ° C C por 10 minutos. A secção foi desidratada, seca ao ar e as sondas fluorescentes específicas para os cromossomas X e Y foram diluídas numa mistura de hibridação (sulfato de dextrano a 10%, 2 x SSC e formamida a 50%) e aplicadas usando uma lamínula. As sondas dos cromossomos X e Y já foram descritas anteriormente (Lau et al., Lancet 1∶14-16; Waye e Willard. Nucleic Acids Res 13∶2731–2743) e foram conjugadas com Alexa Fluor 555 e 488, respectivamente, usando a etiqueta FISH ™ DNA Kit (Molecular Probes, Eugene, OR). As sondas foram desnaturadas a 90 ° C durante 10 minutos. A hibridao foi realizada durante a noite numa cara humidificada a 37 durante 16 horas. Após a hibridação, a secção foi lavada em 2 x SSC, seguida de duas lavagens em 2 x SSC contendo 50% de formamida e uma lavagem final em 2 x SSC. Todas as lavagens pós-hibridação foram realizadas a 42 ° C durante 5 minutos. A secção foi tratada com um tampão de acetato de amónio 50 mM (pH 5) contendo sulfato cúprico 1 mM durante 30 minutos para reduzir a autofluorescência, depois montada com Meio de Montagem VECTASHIELD® contendo 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA) Para facilitar a detecção de núcleos masculinos raros em um grande fundo de núcleos femininos, a seção foi visualizada por varredura automatizada, usando um sistema TissueFAXS (TissueGnostics USA, Tarzana, CA) em modo de fluorescência e a objetiva de 40 ×. As imagens foram revisadas manualmente para qualquer núcleo expressando simultaneamente sinais vermelhos e verdes. Núcleos masculinos putativos foram reexaminados usando o objetivo de 100 × sob imersão em óleo, e as imagens foram coletadas com a opção Z-stack selecionada. As imagens foram deconvolvidas usando o software de análise de imagens 3D Volocity® (PerkinElmer, Waltham, MA). Um exemplo de um núcleo masculino é mostrado (indicado pela seta e mostrado novamente na caixa branca) com uma ampliação final de 400 ×. Os sinais de hibridao foram confirmados como sendo nucleares na localizao ap a deconvoluo das imagens Z-stack contendo o putativo nleo masculino (n mostrado).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592.s002
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Tabela S1
Genotipagem de HLA de uma família para investigação de microquimerismo de origem fetal no cérebro da mãe.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592.s003
(DOC)
Tabela S2
Quantificação do microquimerismo de origem fetal no cérebro da mãe por qPCR específico de HLA.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592.s004
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Tabela S3
Mc prevalência e concentração em mulheres conhecidas por ter pelo menos um filho.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045592.s005
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Agradecimentos
Somos gratos ao Centro de Pesquisa de Doença de Alzheimer da Universidade de Washington (P50 AG05136) e ao Centro de Recursos de Tecido Cerebral de Harvard (R-24-MH 068855) para fornecer espécimes cerebrais específicos da região a partir de autópsias. Agradecemos Aimee Schantz no Centro de Pesquisa de Doença de Alzheimer, George Tejada e Dr. John Hedreen no Centro de Recursos de Tecido Cerebral de Harvard, e Dawn Stief, Samantha Bell e o Experimento Compartilhado de Histopatologia Experimental no Fred Hutchinson Cancer Research Center por sua assistência.
Contribuições do autor
Concebeu e desenhou as experiências: WFNC TJM JLN. Realizamos os experimentos: WFNC CG. Analisou os dados: WFNC CG KAG JLN. Reagentes / materiais / ferramentas de análise: TJM JAS. Escrevi o artigo: WFNC KAG JLN.
Referências
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